OECD 229：内分泌干扰筛查程序 - 鱼短期生殖测定

作者：

Sarah Broadley，BSC（荣誉），MSC，PGCE，研究科学家四，专业病理学服务;Catherine Ross博士，DVM，MSC，MRCVS，病理学家，病理科医学系，英国哈罗盖特

日期：

2021年1月

简介

“内分泌干扰物是一种外源性物质或混合物，它改变内分泌系统的功能，从而对一个完整的有机体、其后代或（亚）种群造成不利的健康影响。”世界卫生组织国际预防犯罪中心，2002年。

内分泌破坏器筛查程序（EDSP）旨在确定杀虫剂，化学或其他物质是否由于内分泌系统破坏而对人体健康或环境产生风险。使用Fathead Minnow（Pimephales Promelas）验证短期再生测定（测试指南229），并在日本Medaka和斑马鱼上的终点子集。该测定将生殖的健身作为使用反映与下丘脑 - 垂体 - （HPG）内分泌轴的干扰相关的作用的组织学和生化终点的毒性效应的综合测量。

法规

2018年，经合组织发布了经修订的内分泌干扰物测试和评估概念框架。该概念框架由五个层次的测试组成，旨在用作工具箱。

1级 -基于现有信息进行排序和优先级。

2级 -体外测定提供机械数据。

第3级 -在体内测定中提供有关所选内分泌机制和效果的数据。

4级 -在体内测定中，为内分泌机制提供有关不利影响的数据。

5级 -体内试验提供了内分泌和其他机制影响的综合数据。

鱼类短期繁殖试验与两栖动物变态试验、子宫营养试验和赫氏试验一起分为3级。

目前，除非要求这样做，否则欧盟没有法定要求使用特定的内分交中中断的测试。

然而，在美国，检测是强制性的，美国环保署已经制定了两级战略。

第1级测定 -体外和体内试验的选择。鱼类短期繁殖试验和两栖动物变态试验属于这一范围。

第2层测定 -In vivo apical assays including Mammalian 2-generation toxicity, Amphibian Growth/Reproduction, Avian 2-generation, Fish 2-generation and Mysid 2-generation.

鱼类短期繁殖试验

Materials and Methods

试验需要三个试验浓度和对照。

斑马鱼（每艘含5个男性和5名女性）的两件血管。

Four vessels per treatment for fathead minnow (each vessel containing 2 males and 4 females due to the territorial behaviour of male fathead minnow).

每次治疗使用四个血管或复制品（每个血管包含3只雄性和3只雌性）。

评估以下参数：

分析化学-每周从水箱中收集水样，以分析测试化学水平。

Vitellogenin（VG） -用ELISA法测定卵黄前蛋白的含量。Vg通常只在雌性鱼类中表达，在雄性鱼类中休眠。然而，当雄性鱼类暴露于内分泌干扰物时，Vg基因以剂量依赖性的方式表达。因此，Vg基因在雄性鱼类中的表达已被用作雌激素性内分泌干扰物暴露的标志。

形态学观察-外观和观察次级性别特征，包括;雄性着色和脂肪垫（终止的存在和体重），与对照相比，延期结节映射，日常评估及行为。

评估受精成功率，目视检查胚胎，统计不育和可育卵数。

繁殖力 -每日鸡蛋生产得到评估。

Survival, behaviour and appearance –与对照组相比，每天观察鱼类的死亡率和异常行为

第二性征观察-在日本Medaka中的雄性迷人MINNOW和乳头状过程中的婚礼结节等二次专业性别特征也观察到。

图1。图中显示了雄性肥头鱼的结婚结节。使用位置模板结节的数量和大小被记录并排名为：0 - 缺席，1 - 礼物，2 - 放大和3 - 发音。

从OECD（2012）转载的图像，测试No.229：鱼短期再生测定，经合组织化学品测试指南，第2节，经合组织出版，巴黎。https://doi.org/10.1787/9789264185265-en。

组织学准备

组织修剪/加工

肥头小鱼-从鱼的性腺中分离出来，整个加工成石蜡。

日本田中和斑马鱼-如果需要，摩卡斯胴体被修剪，并且躯干加工整体到石蜡蜡。

嵌入 -性腺/鱼水平地朝向它们的长轴。

microtomy -通过性腺中心取三步切片，用苏木精和伊红染色。

施工学学

男性-主要诊断标准包括：睾丸卵子分泌增多

睾丸变性增加

间质（间质）细胞增生/肥大

男性 - 二级诊断标准包括：

精原细胞比例下降

增加血管或间质蛋白质流体异步Gonad开发

精母细胞或精子细胞比例的改变性腺分期

肉芽肿炎症

Figure 1. Male fathead minnow gonad, x20 magnification.巴=50µm。

图2雄性肥头鲤鱼性腺，放大40倍。棒=20μm。注意叶片周围排列的精子发育的所有阶段：（1）1˚精菌;（2）2˚精菌;（3）1˚精菌细胞;（4）2˚精骨细胞;（5）精子。

施工学学

女性 - 主要诊断标准包括：

Increased oocyte atresia

紫外线细胞增生/肥大降低蛋黄形成

换气平台变化

女性 - 二级诊断标准包括：

间质纤维化

输卵管内虫卵碎片肉芽肿性炎症排卵后卵泡减少

图3.母脚垫MINNIN GONAD，X4放大率。条=200μm。卵母细胞发育的注意事项在两个数字中：（1）Perinuclectlecytes;（2）皮质肺泡卵母细胞;（3）早期vitellogenic卵母细胞;（4）晚期vitellogenic卵母细胞。

图4.雌性Fathead Minnow Gonad，X40放大率。棒=20μm。