蛋白结合

方法

• 血浆蛋白结合方法
  • 测试系统：来自各物种的混合血浆或特定的血浆蛋白溶液（如人血清白蛋白、α₁酸性糖蛋白、丙种球蛋白）
  • 选择浓度以归类已知的临床风险（0.1 - 10X C_max），除非受到溶解度的限制。

  平衡透析

  采用高通量透析仪（HTDialysis LLC、Gales Ferry、CT）进行平衡透析。向供体腔内添加强化基质（血浆或分离血浆蛋白），同时在接收腔室内添加杜伯科磷酸缓冲盐溶液（DPBS）。然后用透气薄膜密封培养皿，并根据指定时长在37°C的温度下在5%的CO₂中进行培养（见下文）。完成培养之后，使用液相色谱-质谱联用法（LC-MS）对来自每个腔室的样品进行分析。

  • 基质稳定性：供试品以单一浓度并按最多五个时间点在血浆和DPBS中进行培养。
  • 达到平衡的时间：将单一浓度的供试品添加至血浆中，并按最多五个时间点通过DPBS进行透析。
  • 蛋白质结合浓度依赖性：将三种浓度的供试品添加至血浆中，并按达到平衡所需时长通过DPBS进行透析。
  • 在并行平台透析中间行每行≥5小时的阳台对照，如香豆素。

  超滤

  强化血浆将被添加至超滤装置（分子量筛截为30,000 Da）的样品储存部分。样品将在37°C的温度和2,000 × g的条件（或其他适当条件）下进行15分钟的离心分离。完成离心分离之后，将使用LC-MS对供试品及内容的超滤液进行分析，并与初始浓度进行比较。所有的蛋白结合测定将按一式三份进行。

  • 非特异性综合：将两种浓度的装饰品加载至至血浆超滤液（puf）中，并根据超滤规程进离心分享分享到。品质的回收率和所在的非特异性料。
  • 蛋白质结合浓度依赖性：将五种浓度的供试品添加至血浆中，并根据超滤规程进行离心分离。将对供试品的超滤液进行分析。

  超速离心法

  强化血浆将被放入超速离心管中，在37°C的温度和223,000 × g的条件（或其他适当条件）下进行4小时的离心分离，以实现血浆与血浆蛋白的超速分离。完成离心分离之后，将使用LC-MS对超速离心液进行分析，并与初始浓度进行比较。

  • 非特异性结合：将两种浓度的供试品添加至对照人血浆和血浆超滤液（PUF）中，并在超速离心管中培养4小时。将对基质进行分析，以确定在没有血浆的情况下供试品的回收率和潜在的非特异性结合。
  • 蛋白质结合浓度依赖性：将五种浓度的供试品添加至血浆中，并根据超速离心法规程进行离心分离。将对供试品的超速离心液进行分析。
• 血液-血浆分隔方法

  BPP研究被用于对在不同物种（包括人类）血液中的供试品进行体外血液-血浆分隔测定。

  • 测试系统：从每个动物种类获取的血液可能由至少三个供体进行混合。为混合的动物血液样本和个人血液样本确定红细胞比容值。
  • 为混合的动物血液样本和个人血液样本确定红细胞比容值。
  • 血液在2-8°C的温度下储存，并在收到后1周内尽快使用。

  将供试品添加到血液中并进行初始取样。如图所示，强化血液在37°C的温度下进行培养。完成培养之后，移除试样进行分析。剩余的血液通过离心分离获得血浆；收集试样以进行分析并与初始试样进行比较。

  • 基质稳定性：供试品以单一浓度并按最多四个时间点在血液中进行培养。
  • 达到平衡的时间：将单一浓度的供试品按最多四个时间点添加至血液中。
  • 蛋白质结合浓度依赖性：将最多5种浓度的供试品添加至血液中，并按达到平衡的时间点进行培养。

  对于放射性标记供试品，将在液体闪烁计数（LSC）之前进行血样增溶。对于非放射性标记供试品，将在使用液相色谱-质谱联用法（LC-MS）进行提取和分析之前对血样进行细胞溶解。

• 微粒体蛋白结合方法

  饰品与人类繁体蛋白综合性力的体外有人在使这些潜的检测方法中校正致素合并分数。

  采用高通量透析仪（HTDialysis LLC、Gales Ferry、CT）进行一式三份的平衡透析。将强化微粒体添加至供体腔室内，同时在接收腔室内添加检测缓冲液。然后用透气薄膜密封培养皿，并在37°C的温度下在5%的CO₂中培养5小时。完成培养之后，使用液相色谱-质谱联用法（LC-MS）对来自每个腔室的样品进行分析。

  • 蛋白结合：人肝微粒体在磷酸盐缓冲液中按三种浓度（0.05、0.1、0.5 mg/mL）进行稀释。然后将三种浓度的供试品添加至微粒体中，制备共9个样本。将一式三份的强化基质样本转移到HTD供体室，并通过磷酸盐进行5小时的透析。
  • 微粒体稳定性：将上述强化基质样本在37°C的温度下在5%的CO₂中培养0和5小时。