OECD 229：内分泌干扰筛查程序 - 鱼短期生殖测定

作者：

Sarah Broadley，BSC（荣誉），MSC，PGCE，研究科学家四，专业病理学服务;Catherine Ross博士，DVM，MSC，MRCVS，病理学家，病理科医学系，英国哈罗盖特

日期：

1月2021年

介绍

'内分泌破坏器是改变内分泌系统的功能的外源性物质或混合物，从而导致完整生物体或其后代或（次）群体中的不良健康影响WHO-ICPS, 2002年。

内分泌破坏器筛查程序（EDSP）旨在确定杀虫剂，化学或其他物质是否由于内分泌系统破坏而对人体健康或环境产生风险。使用Fathead Minnow（Pimephales Promelas）验证短期再生测定（测试指南229），并在日本Medaka和斑马鱼上的终点子集。该测定将生殖的健身作为使用反映与下丘脑 - 垂体 - （HPG）内分泌轴的干扰相关的作用的组织学和生化终点的毒性效应的综合测量。

法规

2018年，经合组织发布了修订后的《内分泌干扰物检测和评估概念框架》。概念框架包括五个级别的测试，被设计为一个工具箱。

1级 -基于现有信息进行排序和优先级。

2级 -体外测定提供机械数据。

第3级 -在体内测定中提供有关所选内分泌机制和效果的数据。

4级 -在体内测定中，为内分泌机制提供有关不利影响的数据。

5级 -体内分析为内分泌和其他机制的影响提供了全面的数据。

鱼类短期再生测定与两栖变态测定，uterot养术测定和舍尔赫格的测定相同。

目前，除非要求这样做，否则欧盟没有法定要求使用特定的内分交中中断的测试。

然而，在美国。然而，测试是强制性的，美国EPA制定了双重策略。

第1级测定 -在体外和体内测定中的选择。鱼短期繁殖测定和两栖动物变态测定落入这一系列测试。

第2层测定 -体内顶端测定，包括哺乳动物2代毒性，两栖生长/繁殖，AVIAN 2代，鱼2代和Mysid 2代。

鱼类短期繁殖试验

材料和方法

测试需要三种测试浓度和对照。

斑马鱼（每艘含5个男性和5名女性）的两件血管。

每次治疗四件船舶毛皮MINNOW（每艘含有2名男性和4名女性的血管行为，由于雄性迷人MINNON的领土行为）。

每次治疗的四个血管或重复用来用于日本MEDAKA（每艘含有3个男性和3名女性的容器）。

评估以下参数：

分析化学,每周水样来自坦克分析测试化学水平。

Vitellogenin（VG） -采用ELISA法测定该卵黄前体蛋白的含量。Vg通常只在雌鱼中表达，在雄鱼中处于休眠状态。然而，当雄性鱼暴露于内分泌干扰物时，Vg基因以剂量依赖的方式表达。因此，雄性鱼的Vg基因表达被用作暴露于雌激素性内分泌干扰物的标志。

形态学观察,外观和观察次级性别特征，包括;雄性着色和脂肪垫（终止的存在和体重），与对照相比，延期结节映射，日常评估及行为。

评估受精成功，肉眼检查胚胎，计数不孕和受精卵。

繁殖力 -每日鸡蛋生产得到评估。

生存，行为和外观 -每天观察鱼，用于死亡率和相对于控件的异常行为

第二性征观察-在日本Medaka中的雄性迷人MINNOW和乳头状过程中的婚礼结节等二次专业性别特征也观察到。

图1所示。图中显示雄性黑头鲦鱼的婚礼结节。使用位置模板结节的数量和大小被记录并排名为：0 - 缺席，1 - 礼物，2 - 放大和3 - 发音。

从OECD（2012）转载的图像，测试No.229：鱼短期再生测定，经合组织化学品测试指南，第2节，经合组织出版，巴黎。https://doi.org/10.1787/9789264185265-en。

组织学准备

组织调整/处理

傻瓜小鱼,生殖腺从鱼身上分离出来，整个加工成石蜡。

日本青鳉和斑马鱼如果需要，摩卡斯胴体被修剪，并且躯干加工整体到石蜡蜡。

嵌入 -鱼的生殖腺和它们的长轴呈水平方向。

microtomy -从性腺中心取三步切片，用苏木精和伊红染色。

组织病理学

男性 - 主要诊断标准包括:精原细胞比例增加睾丸-卵子存在

增加睾丸退化

间质（Leydig）细胞增生/肥大

男性 - 二级诊断标准包括：

细菌苷酸的比例减少

增加血管或间质蛋白质流体异步Gonad开发

精母细胞或精子细胞比例的改变性腺分期

肉芽肿炎症

图1.雄性Fathead Minnow Gonad，X20倍率。Bar = 50µm。

图2。雄性黑头米诺鱼的性腺，40倍放大。棒=20μm。注意叶片周围排列的精子发育的所有阶段：（1）1˚精菌;（2）2˚精菌;（3）1˚精菌细胞;（4）2˚精骨细胞;（5）精子。

组织病理学

女性 - 主要诊断标准包括：

增加卵母细胞休息时间

紫外线细胞增生/肥大降低蛋黄形成

换气平台变化

女性 - 二级诊断标准包括：

间质纤维化

输卵管内卵泡碎片肉芽肿性炎症排卵后卵泡减少

图3.母脚垫MINNIN GONAD，X4放大率。条=200μm。卵母细胞发育的注意事项在两个数字中：（1）Perinuclectlecytes;（2）皮质肺泡卵母细胞;（3）早期vitellogenic卵母细胞;（4）晚期vitellogenic卵母细胞。

图4.雌性Fathead Minnow Gonad，X40放大率。棒=20μm。