蛋白结合

• 试验系统:混合每个物种的血浆或特定的血浆蛋白溶液(如人血清白蛋白，α)₁- 酸糖蛋白，γ-球蛋白）
• 浓度被选择为托架已知临床风险（0.1 - 10XÇ_马克斯)，除非受溶解度限制。

平衡透析

使用高通量透析仪(ht透析LLC, Gales Ferry, CT)进行平衡透析。将强化基质(血浆或分离的血浆蛋白)加入供体腔，同时将Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(DPBS)加入到每口井的接收腔中。然后用透气膜密封板，在37°C 5% CO中孵育₂(见下文)。培养后，从每个箱中取出的样品将使用液相色谱-质谱(LC-MS)进行分析。

• 稳定性在矩阵：将试验制品在血浆和在DPBS中以高达五个时间点的单一浓度温育。
• 平衡时间:将测试品以单一浓度添加到血浆中，并对DPBS进行透析，最多可达5个时间点。
• 蛋白结合浓度依赖性：测试物品被添加到等离子体在三种浓度和透析DPBS用于平衡所需的时间。
• 阳性对照，如华法林，进行≥5小时平行平衡透析试验。

超滤

强化等离子体将被添加到一个分子量截止为30,000 Da的超滤装置的样品库部分。样品将在37°C和2000×g离心15分钟(或其他适当条件)。离心后，超滤液将用LC-MS分析测试物和含量，并与初始浓度进行比较。所有蛋白结合的检测将一式三份进行。

• 非特异性结合:加入试样以两种浓度控制血浆超滤液(PUF)，按超滤程序离心。透析液将被分析，以确定在无血浆的情况下被试物的恢复和潜在的非特异性结合。
• 蛋白结合浓度依赖性:将试样按5个浓度加入血浆，按超滤程序离心。对试样进行超滤液分析。

超速

设防等离子体将被添加到超速离心管中，并在37℃离心223000×g下4小时（或其他合适的条件），以实现从血浆蛋白血浆ultracentrifugate的分离。离心后，将ultracentrifugate通过LC-MS进行分析，并与初始浓度。

• 非特异性结合：试验制品被添加在两个浓度来控制人的血浆和血浆超滤液（PUF），并在超速离心管中温育4小时。该矩阵将被分析，以确定试验制品和非特异性在没有等离子体的结合潜在的恢复。
• 蛋白结合浓度依赖性:将试验品按5个浓度加入血浆，按超离心方法离心。将分析超循环门作为试验品。

BPP研究用于确定不同物种(包括人类)血液中被试物的体外血液-血浆分割。

• 测试系统：从每个动物物种获得血液可以从至少三个供体汇集。至少从三个志愿者获得人血不会被合并。
• 血细胞比容值的汇集动物的血液样品和人类个体的血液样品来确定。
• 血液被储存在2-8℃，1周的收据内尽快使用。

将试验物品加入血液中，并取初始aliquots。如所示，强化血液在37°C培养。孵育后，取下aliquots进行分析。将剩余血液离心，获得血浆;收集aliquots进行分析并与初始aliquots进行比较。

• 基质稳定性:试验品在血液中以单一浓度孵育，最多可孵育四个时间点。
• 达到平衡的时间:将试验物品以单一浓度添加到血液中，最多可达四个时间点。
• 蛋白结合浓度依赖:将试验品以5个浓度添加到血液中，并孵育至平衡时间点。

对于放射标记的试验物品，在液体闪烁计数(LSC)之前，血液中的脂质被溶解。对于非放射性标记的测试物品，在提取和使用液相色谱-质谱(LC-MS)分析之前，将血液成分溶解。

对试验品在体外与人肝微粒体蛋白结合的潜力进行评估，可以在使用这些系统的试验中校正未结合部分。

使用高通量透析仪(ht透析LLC, Gales Ferry, CT)在三组病例中进行平衡透析。在供体室中加入强化的微粒体，同时在每个孔的接收室中加入一个检测缓冲液。然后用透气膜密封板，在37°C 5% CO中孵育₂5小时。培养后，从每个箱中取出的样品将使用液相色谱-质谱(LC-MS)进行分析。

• 蛋白结合:将人肝微粒体稀释至三种浓度(0.05,0.1,0.5 mg/mL)磷酸盐缓冲液中。然后将测试品以三种浓度添加到微粒体中，共9个样品。强化基质样品转移到HTD供体腔中，并与磷酸盐对抗透析5小时。
• 微粒体稳定性:上述强化基质样品在37°C 5% CO中孵育₂0和5小时。