酶诱导

CYP酶（典型的CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4）的诱导是在人体肝细胞单层培养中暴露于供试品后在体外进行测定的。

初步实验应研究诱导CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4酶的可能性。如果观察到CYP3A4酶的诱导，申办方还应评估CYP2C酶（CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19）的诱导潜力。然后将其效果与所研究的CYP酶的阳性对照诱导物诱导的效果进行比较。此外，可以将离体动物肝脏（通常是小鼠、大鼠、狗或猴子）加工成亚细胞组分，并用于评估试验期间体内给药后供试品对药物代谢酶的介导作用安全评估研究。

• 试验系统：个体人供肝细胞，冷冻保存
• 评估的CYP酶：CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4/5。
• 供试品浓度：选择用于预测临床暴露（0.1–10倍C_最大值)，除非受溶解度限制。选择5个浓度用于细胞毒性，7个浓度用于mRNA诱导，3个浓度用于酶活性诱导
• 孵育时间：72小时，每24小时更新一次培养基。

细胞毒性

在初步分析中，来自一个供体的肝细胞在有供试品（五种浓度）或阳性对照他莫昔芬（50µM）存在的情况下在37°C、5%CO2的加湿培养箱中培养72小时，每24小时交换一次培养基±供试品或对照品。72小时后，用MTS法检测肝细胞的活性。结果将用于确定诱导试验的无毒供试品浓度。

稳定性

结合细胞毒性试验，收集培养基样品以评估随时间变化的供试品浓度。

cypmrna诱导

来自三个供体的肝细胞在有或无供试品（七种浓度）或对照诱导物（见下文）的情况下，在37°C、5%CO2的加湿培养箱中培养72小时，每24小时交换一次培养基±供试品或对照物。72h后提取mRNA，实时定量PCR检测基因表达。每个cypmrna的水平被标准化为内源性控制基因的水平（例如GAPDH）。然后使用2-ΔΔCT方法计算CYP基因表达的倍数诱导。与溶媒对照组相比，供试品依赖性CYP mRNA水平增加≥2倍，或反应≥阳性对照组反应的20%，可解释为阳性结果。

CYP酶诱导

来自三个供体的肝细胞在有或无供试品（三种浓度）或对照诱导物（如上所述）的情况下在37°C、5%CO2的加湿培养箱中培养72小时，每24小时交换一次培养基±供试品或对照物。72小时后，肝细胞在含有适当CYP底物（见下文）的新鲜培养基中培养2小时，之后终止反应，并使用液相色谱-质谱（LC-MS）分析方法收集样品以分析代谢物（见下文）。与溶媒对照组相比，供试品依赖性CYP酶活性增加≥2倍，或反应≥阳性对照组反应的20%，可解释为阳性结果。

可交付成果

与已知的CYP酶诱导物相比，这些分析将提供mRNA和酶活性水平。欧共体₅₀和E_最大值如适用，将提供。

如果观察到阳性结果，药理学在评估临床试验的必要性时，可以提供额外的指导。