药物 - 药物相互作用及转运蛋白

• 测试系统：表达单个摄取（SLC）转运蛋白或载体对照的转染细胞系，在5％CO中的37℃下在潮湿培养箱中生长在单层中。₂。
• 测定缓冲液：HBSS与HEPES，pH 7.4
• 仅用于伴侣转运蛋白，细胞用NH预处理_4.CL在细胞膜上引入pH梯度，所需的配偶摄取活性
• Test article concentrations: 2 for substrate assays, 2 for inhibition assays
• Radioalabeled probe substrates specific for each transporter
• 每个运输扣的阳性对照抑制剂

培养物中的培养物的表达细胞用测定缓冲液预孵育在5％CO中的37℃下在潮湿的培养箱中预孵育30分钟₂。用NH 4 Cl处理交配的细胞以在细胞膜中产生pH梯度，以促进摄取活性。将探针基板或试验制品加入三份孔中，并在适用的情况下添加抑制剂。根据转运蛋白，将平板从2-10分钟孵育一次点。缓冲剂吸出来;洗涤细胞，然后用LC-MS裂解，收集并分析测试制品的存在。

Substrate assessment: Uptake of the test article by each transporter alone or in the presence of selective inhibitor will be compared to uptake by the vector control after incubation for 2-5 minutes. Uptake of a probe substrate by each transporter alone or in the presence of selective inhibitor and by the vector control will be performed as controls.

抑制剂评估：每个转运蛋白摄取探针基材单独或在选择性抑制剂或试验制品存在下进行。通过载体控制的探针基板的摄取也将作为对照进行。如果观察到抑制，IC_50.可以确定。

• 测试系统：Caco-2人肠内加管细胞，在5％CO中的37℃下在潮湿培养箱上培养在Transwell平板上₂21-24天
• 测定缓冲液：HBSS含有HEPES，在顶端和基石室中的pH 7.4
• 在测定之前测量转​​换电阻（Teer）以确认形成紧密连接的形成
• Test article concentrations: 2 for substrate assays, 2 for inhibition assays
• 放射性标记的渗透性标记甘露醇和咖啡因用于验证紧密的接线形成
• Radiolabeled probe substrates are used, specific for each transporter
• Positive control selective inhibitors for each transporter with negative inhibitor controls

测试制品和探针底物的表观渗透性在顶端至基石（A-B）中和基于Transwell平板上的顶端（B-A）方向的基础上的渗透性。在5％Co中的37℃下在37℃下在潮湿培养箱中预孵育30分钟后在5％CO₂，探针或试验制品将腔室（供体）添加到相对腔室（接收器）中的空白缓冲器。然后将抑制剂加入适用的两个腔室中。将板在37℃下在5％CO中孵育₂持续2个小时。收集供体和接收室样品并使用LC-MS分析测试制品的存在。然后确定测试物品渗透率和排出率。

基材评估：单独或在选择性抑制剂存在下，在两个方向上确定测试制品的运输。单独或在选择性抑制剂存在下单独或在选择性抑制剂存在下运输探针基板作为对照。

抑制剂评价:探针substra运输te will be determined in both directions after incubation for 2 hours alone or in the presence of selective inhibitor or the test article. If inhibition of efflux transport is observed, the IC_50.可以确定。

• 试验系统：表达流出（ABC）转运仪BSEP的膜囊泡（50μg/孔）。
• 测试制品浓度：2用于底物测定;2用于抑制测定。
• 腺苷三磷酸（ATP） - 依赖性活性测量，用腺苷一磷酸（AMP）用作对照。
• Radiolabeled probe substrate specific for BSEP
• 每个运输扣的阳性对照抑制剂

表达BSEP的膜囊泡和试验制品或探针基材将在96孔板中温育。通过添加腺苷三磷酸（ATP）来引发摄取，然后在37℃下孵育30分钟。腺苷一磷酸盐（AMP）将与阴性对照并联使用。吸收将通过真空吸入终止，并用过量的冰冷的传输缓冲液漂洗两次过滤器。然后从过滤板中提取囊泡，用于LC-MS定量和计算ATP依赖性活性。

Substrate assessment: Uptake of the test article alone and with selective inhibitor in the presence of ATP will be compared to uptake in the presence of AMP. Uptake of a probe substrate by BSEP alone and in the presence of selective inhibitor will be performed as controls.

Inhibitor assessment: Uptake of a probe substrate will be conducted alone and in the presence of selective inhibitor or the test article; uptake in the presence of ATP will be compared to uptake in the presence of AMP. If inhibition of ATP-dependent uptake of the test article is observed, the IC_50.可以确定。