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作者:安德鲁便士。Karalewitz博士。
日期: 2021年3月
免疫疗法代表了癌症治疗的最新技术。通过利用免疫系统的精细特异性，现代免疫疗法可以针对癌细胞类型而设计，同时避免健康组织。诺华公司的Kymriah™和Kite/Gilead公司的Yescarta™是fda批准的细胞免疫疗法，分别用于急性淋巴母细胞白血病和弥漫大B细胞淋巴瘤的治疗。
为了生产Kymriah™或Yescarta™，患者的T细胞被设计成表达Chimeric一个ntigenR靶向CD19 B淋巴细胞分子的受体(CARs)(1)。随着抗CD19 CAR - T细胞治疗血癌的临床成功，下一代增强活性和安全性的CARs正在设计中。
Labcorp临yaboapp体育官网床前肿瘤(PCO)报价Chimeric一个ntigenR受体(CAR) T细胞的生成。这项服务解决了对用于早期发现研究的可靠来源CAR - T细胞日益增长的需求。赞助商可以使用预制的抗cd19 CAR - T细胞，或者客户可以使用定制的CAR - T细胞生成服务提供慢病毒颗粒来表达他们选择的CAR。yaboapp体育官网对多个候选CAR的临床前评估将使资助者能够确定最活跃的CAR，以便在药物开发过程中取得进展。CAR - T细胞生成服务建立在产生表达荧光素酶细胞株的以往经验之上，并辅之以内部处理和培养T细胞和CAR - T细胞的专业知识。CAR - T细胞生成服务可以产生足够数量的用于早期发现研究的CAR - T细胞。
CAR - T细胞生成工作流程由三个不同的技术阶段组成:CAR - T细胞生成，流式细胞术评估CAR - T表达，和a在体外杀灭试验检测CAR - T细胞活性。的在体外如果赞助方已经有了CAR - T细胞的来源，并且有兴趣使用客户可用的多种癌细胞系之一来测试CAR - T细胞的功能，那么杀伤试验可以作为一种独立的服务。在本Spotlight模型中，CAR - T细胞生成服务以抗cd19 CAR为例进行了演示。
通过慢病毒转导产生抗cd19 CAR - T细胞
CARs是合理设计的蛋白，由细胞外抗原受体融合到细胞内信号域。抗原受体通常基于单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(ScFv)。细胞内信号域由T细胞特异性活性调节剂组成，如4-1-BB和TCR-ζ胞浆信号链(CD3ζ)(图1)(1).为了产生抗cd19 CAR - T细胞，使用慢病毒表达系统将编码CAR结构的遗传物质传递到T细胞中。来自健康献血者的人外周血单个核细胞(hPBMCs)被慢病毒转导，在培养中扩增，随后冷冻保存以备将来使用。经病毒转导的T细胞或未转导的T细胞(UTD)会增殖转导后达到90%以上的活力(图1B及1C)．
图1-抗cd19 CAR - T细胞合成。(一)描述抗cd19 CAR功能域组织的示意图。基于FMC63 mAb的抗cd19单链可变片段(single chain variable fragment, ScFv)是细胞外抗原结合域。CD8铰链和跨膜结构域连接细胞外和细胞内结构域。抗cd19 CAR的细胞内信号部分来源于4-1-BB和CD3ζ。(B)用吖啶橙和碘化丙啶(AO/PI)测定活T细胞计数。(C) AO/PI法检测T细胞活力。生长曲线和日生活力测量是两个独立转导的代表。
抗cd19 CAR表面表达的评估
抗cd19 CAR - T细胞的功能分析是确定慢病毒转导是否成功的必要条件。流式细胞术用于量化CAR+ T细胞的数量，并确定转导效率。使用一种特异性结合FMC63 ScFv的mAb来测量抗cd19 CAR的表面表达(图2)。通过门控排除二重体和碎片，鉴定活细胞，并测定CAR的表达。未转导(UTD) T细胞为96%的CD3+和0.14%的CD3+/CAR+(图2 b)。在用慢病毒处理T细胞后，大约25%的T细胞是CD3+/CAR+(图2)。CD3+/CAR+双阳性T细胞百分比的增加表明转导成功。基于活性染料排除，UTD和抗cd19 CAR - T细胞的活性均大于90%。
图2-流式细胞术检测抗cd19 CAR表面表达。(A)流式细胞术染色鉴定阳性转化子示意图。未转导的T细胞(UTD)不表达抗cd19 CAR，也不与抗scfv单抗结合(左)。在慢病毒转导(+病毒)后，抗单克隆抗体将结合表达抗cd19 CAR的T细胞(右)。(B)具有代表性的流式细胞术图。活细胞是根据活性染料排除鉴定的。UTD T细胞有96%的存活率，人CD3 (hCD3+/anti-CAR-)单阳性(象限1,Q1)(98.3%)。UTD T细胞不表达抗cd19 CAR (hCD3+/抗CAR+)(象限2,Q2)(0.14%)。(C)具有代表性的流式细胞术图。抗cd19 CAR - T细胞存活率为96.5%，表达抗cd19 CAR (hCD3+/抗CAR+)(象限2)(25.1%)。 SSC = side scatter.
抗cd19 CAR - T细胞功能的评估
为了确定抗cd19 CAR - T细胞是否有功能，进行了靶细胞杀伤试验(图3)。简单地说，靶细胞与UTD或抗cd19 CAR - T细胞共培养。第二天，用流式细胞仪检测靶细胞活力。抗CD19 CAR - T细胞可以特异性杀伤表达CD19的靶细胞，而对不表达CD19的靶细胞没有作用。采用流式细胞术检测CD19在靶细胞表面的表达(图3 b)。NALM6细胞表达CD19, MV-4-11细胞不表达(图3 b)。
图3- CAR - T细胞毒性试验设计和靶细胞鉴定。(A)概述细胞毒性试验主要步骤的流程图。NALM6:急性淋巴母细胞白血病细胞。阴性对照，双表型b -骨髓单核细胞白血病，MV-4-11细胞。T细胞和靶细胞输入使用自动细胞计数器和AO/PI进行计数。(B)流式细胞术检测靶细胞表面CD19的表达。直方图显示了当CD19单抗缺失(-)和缺失(+)时MV-4-11和NALM6的CD19表达水平。NALM6细胞表达CD19, MV-4-11细胞不表达CD19。
抗cd19 CAR - T细胞对NALM6细胞有细胞毒性吗(图4)。确定了CD19+ NALM6细胞和CD3+ T细胞的种群。对CD19+总细胞进行门控后，测定CD19+死亡细胞的百分比。活细胞为CD19+/活力染色阴性。单独培养的靶细胞存活率约为96%。反向门显示死亡目标细胞的百分比(3.7%)(图1)．与UTD T细胞孵育的NALM6细胞相比，抗cd19 CAR - T细胞孵育孔中NALM6细胞死亡的比例更高(图4A、B和C)。UTD和抗cd19 CAR - T细胞对MV-4-11细胞的细胞毒性百分比相同(图4 d)。结果表明，抗cd19 CAR - T细胞对表达cd19的靶细胞具有特异性活性，验证了CAR - T细胞生成服务的成功
图4-抗cd19 CAR - T细胞功能评估。(A)用未转导的T细胞进行NALM6杀伤试验的代表性流式细胞术图。对总靶细胞进行活性染料摄取分析。死亡目标细胞门数代表活细胞门外细胞的百分比。顶部为阴性对照靶细胞样本(0:1,T细胞:靶细胞比例)。下面是3:1的结果，T细胞与靶细胞的比例。(B)用抗cd19 CAR - T细胞进行NALM6杀伤实验的代表性流式细胞术图。如A. (C) NALM6细胞毒性试验结果。稀释后的总T细胞与NALM6细胞一起孵育。如A和b分析。每个数据点和误差柱代表三次共培养的平均值和标准差。 (D) Results of MV-4-11 cytotoxicity assay. Assay was conducted and analyzed as with NALM6 cells except MV-4-11 target cells were identified by staining for a non-CD19 surface protein. Representative flow cytometry plots not shown. Cytotoxicity assay results are representative of two independent experimental replicates.
总结
从健康的人类pbmc开始，Labcorp的CAR - T代服务生产足够数量的CAR+ T细胞在体外和在活的有机体内鉴定。本文描述的CAR - T细胞代服务生产的最终产品是>95% CD3+， >90%活菌，对表达cd19的人淋巴母细胞白血病细胞具有特异性的细胞毒性。T细胞转导协议基于已建立的技术，也适用于替代的CAR结构，允许Labcorp为我们的客户提供定制的CAR - T生成服务(2)。生成用于临床前研究的CAR - T细胞将促进我们客户使用组合或新的CAR - T疗法的早期发现项目。yaboapp体育官网
参考文献
1) June CH, O’connor RS, Kawalekar OU, Ghassemi S, Milone MC. CAR - T细胞免疫治疗人类癌症。科学。2014;359 (6382): 1361 - 1365
2) Quintás-Cardama A, Yeh RK, Hollyman D, Stefanski J, Taylor C, Nikhamin Y, Imperato G, Sadelain M, Rivière I, Brentjens RJ。γ病毒基因转染人T淋巴细胞的多因素优化及其临床应用Hum Gene Ther. 2007;18日(12):1253 - 60
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