OECD 229：内分泌干扰筛查程序 - 鱼短期生殖测定

奥特:

Sarah Broadley，BSC（荣誉），MSC，PGCE，研究科学家四，专业病理学服务;Catherine Ross博士，DVM，MSC，MRCVS，病理学家，病理科医学系，英国哈罗盖特

基准：

Januar 2021

Einfuhrung

“内分泌干扰物是一种外源性物质或混合物，它会改变内分泌系统的功能，从而对完整生物体、其子代或(亚)种群造成不利的健康影响。”WHO-ICPS, 2002年。

内分泌干扰物筛选计划(EDSP)旨在确定一种杀虫剂、化学物质或其他物质是否会因内分泌系统的紊乱而对人类健康或环境构成风险。短期繁殖试验(试验指南229)使用黑头鲦鱼(Pimephales promelas)和日本青鳉和斑马鱼的一个端点子集进行验证。该试验将生殖适合度作为毒物作用的综合衡量，使用一套组织和生化终点，反映了与下丘脑-垂体-性腺(HPG)内分泌轴紊乱相关的影响。

Regulierungen

2018年，经合组织发布了修订后的《内分泌干扰物检测和评估概念框架》。概念框架包括五个级别的测试，被设计为一个工具箱。

1级 -基于现有信息进行排序和优先级。

二级-体外测定提供机械数据。

三级-体内分析提供有关内分泌机制和作用的数据。

四级-体内分析提供了有关内分泌机制的不良影响的数据。

5级-体内分析为内分泌和其他机制的影响提供了全面的数据。

鱼类短期再生测定与两栖变态测定，uterot养术测定和舍尔赫格的测定相同。

目前，除非要求这样做，否则欧盟没有法定要求使用特定的内分交中中断的测试。

然而，在美国。然而，测试是强制性的，美国EPA制定了双重策略。

第1级测定 -体外和体内试验方法的选择。鱼类短期繁殖试验和两栖类变态试验都属于这一范围。

二级分析-包括哺乳动物2代毒性、两栖动物生长繁殖、鸟类2代、鱼类2代和Mysid 2代。

鱼类短期繁殖试验

材料和方法

测试需要三种测试浓度和对照。

斑马鱼（每艘含5个男性和5名女性）的两件血管。

每次处理四艘黑头米诺鱼(由于雄性黑头米诺鱼的地盘行为，每艘船载2只公鱼和4只母鱼)。

每次治疗的四个血管或重复用来用于日本MEDAKA（每艘含有3个男性和3名女性的容器）。

评估以下参数：

分析化学,每周水样来自坦克分析测试化学水平。

Vitellogenin（VG） -采用ELISA法测定该卵黄前体蛋白的含量。Vg通常只在雌鱼中表达，在雄鱼中处于休眠状态。然而，当雄性鱼暴露于内分泌干扰物时，Vg基因以剂量依赖的方式表达。因此，雄性鱼的Vg基因表达被用作暴露于雌激素性内分泌干扰物的标志。

形态学观察,外观和观察次级性别特征，包括;雄性着色和脂肪垫（终止的存在和体重），与对照相比，延期结节映射，日常评估及行为。

评估受精成功，肉眼检查胚胎，计数不孕和受精卵。

繁殖能力,对每天的鸡蛋产量进行评估。

生存，行为和外表每天观察鱼，用于死亡率和相对于控件的异常行为

第二性征观察-此外，还观察到雄性黑头鲦鱼的婚结节和日本青鳉的乳头突起等次级特化性特征。

图1所示。图中显示雄性黑头鲦鱼的婚礼结节。使用位置模板结节的数量和大小被记录并排名为：0 - 缺席，1 - 礼物，2 - 放大和3 - 发音。

从OECD（2012）转载的图像，测试No.229：鱼短期再生测定，经合组织化学品测试指南，第2节，经合组织出版，巴黎。https://doi.org/10,18/978926418/9785-en。

组织学准备

组织调整/处理

傻瓜小鱼,生殖腺从鱼身上分离出来，整个加工成石蜡。

日本青鳉和斑马鱼如果需要的话，鱼的胴体会被修整，躯干会被整个加工成石蜡。

嵌入,鱼的生殖腺和它们的长轴呈水平方向。

切片法,从性腺中心取三步切片，用苏木精和伊红染色。

Histopathologie

男性-主要诊断标准包括:精原细胞比例增加睾丸-卵子存在

增加睾丸退化

间质（Leydig）细胞增生/肥大

男性-次要诊断标准包括:

细菌苷酸的比例减少

血管或间质蛋白液增多性腺发育不同步

精母细胞或精子细胞比例的改变性腺分期

肉芽肿性炎症

图1所示。雄性黑头米诺鱼性腺，20倍放大倍数。Bar = 50µm。

图2。雄性黑头米诺鱼的性腺，40倍放大。Bar = 20µm。所有精子发育阶段均围绕小叶排列:(1)˚原细胞;(2) 2˚Spermatogonia;(3) 1˚精母细胞;(4) 2˚精母细胞;(5)精子。

Histopathologie

女性-主要诊断标准包括:

增加卵母细胞闭锁

紫外线细胞增生/肥大降低蛋黄形成

性腺分期的改变

女性-二级诊断标准包括:

间质纤维化

输卵管内卵泡碎片肉芽肿性炎症排卵后卵泡减少

图3。雌性黑头米诺鱼的性腺，放大倍数4倍。Bar = 200µm。两幅图中均需注意卵母细胞发育阶段:(1)核周卵母细胞;(2)皮层泡状卵母细胞;(3)早期卵黄形成的卵母细胞;(4)卵黄发生晚期的卵母细胞。

图4.雌性Fathead Minnow Gonad，X40放大率。Bar = 20µm。