蛋白质结合

• 检测系统:从每个物种或特定的血浆蛋白溶液(例如，人血清白蛋白，α₁- 酸糖蛋白，γ-球蛋白）
• 选择浓度以支架已知的临床暴露（0.1 - 10x C._最大限度），除非溶解度有限。

平衡透析

使用高通量透析装置（HTDIALYSIS LLC，GALES FERRY，CT）进行平衡透析。将强化基质（血浆或分离的血浆蛋白）加入供体室，而Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）被加入每个孔的接收器室。然后用透气膜密封，并在37°C的5% CO中孵育₂为指定的时间(见下文)。孵育后，每个室的样品使用液相色谱-质谱(LC-MS)进行分析。

• 基质中的稳定性：测试制品以血浆和DPBS在最多五个时间点的单次浓度中孵育。
• 均衡时间：将测试制品以单浓度的血浆加入血浆，并透析DPB，最多五个时间点。
• 蛋白质结合浓度依赖性：将测试制品以三种浓度加入血浆，并透析DPBS，以便平衡所需的时间。
• 诸如华法林等阳性对照在平行平衡透析≥5小时的平衡透析中进行测试。

超滤

强化等离子体将被添加到分子量为30,000 Da的超滤装置的样品贮存器部分。样品在37°C和2000 × g条件下离心15分钟(或其他适当条件下)。离心后，超滤液将通过LC-MS分析试验品和与初始浓度的含量。所有蛋白结合检测均为三份。

• 非特异性结合：将试验制品添加以在两个浓度下控制等离子体超滤液（PUF）并根据超滤过程离心。将分析透析液以确定在没有血浆的情况下恢复测试制品和潜在的非特异性结合。
• 蛋白结合浓度依赖性:将试验品以五种浓度加入血浆，按超滤程序离心。将对超滤液进行分析。

超速离心

强化等离子体将加入超速纤维管中，并以323,000×g以37℃以323,000×g离心4小时（或其他适当的条件），以从血浆蛋白中达到等离子体超速离心蛋白的分离。离心后，将通过LC-MS分析超速离心并与初始浓度进行比较。

• 非特异性结合：将试验制品加入到控制人血浆和血浆超污水（PUF）以两种浓度，并在超速纤维管中温育4小时。将分析基质以确定在没有血浆的情况下恢复测试制品和潜在的非特异性结合。
• 蛋白质结合浓度依赖性：试验制品以5个浓度加入血浆中并根据超速离心过程离心。将分析超速过度的测试制品。

BPP研究用于确定试验物品在不同物种(包括人类)血液中的体外血液-血浆分离。

• 测试系统：可以从至少三个供体汇集从每种动物物种获得的血液。不会汇集从至少三个志愿者获得的人类血液。
• 针对汇集的动物血液样本和个体人血样确定血细胞比容值。
• 血液在2-8°C储存，并在收到1周内尽快使用。

试验品加入血液中，取初始等量。强化血按照指示在37°C下孵育。孵育后，取下等分进行分析。将剩余的血液离心获得血浆;将Aliquots收集起来进行分析，并与初始Aliquots进行比较。

• 基质中的稳定性:试验品以单一浓度在血液中培养最多四个时间点。
• 均衡时间：测试制品以单一浓度的单浓度加入血液，最多四个时间点。
• 蛋白结合浓度依赖性:将试验品以5个浓度加入血液中，培养至平衡时间点。

对于放射性标记的试验制品，在液体闪烁计数（LSC）之前溶解血液等分试样。对于非放射性标记的试验制品，使用液相色谱 - 质谱（LC-MS）在提取和分析之前裂解血液等分试样。

在体外评估测试物品与人肝微粒体蛋白结合的可能性允许使用这些系统校正测定中的未结合级分。

使用高通量透析仪(ht透析LLC, Gales Ferry, CT)进行三次平衡透析。强化微粒体被添加到供体腔，同时检测缓冲液被添加到每孔的接受腔。然后用透气膜密封，并在37°C的5% CO中孵育₂5个小时。孵育后，每个室的样品使用液相色谱-质谱(LC-MS)进行分析。

• 蛋白结合:将人肝微粒体在磷酸盐缓冲液中稀释至0.05、0.1、0.5 mg/mL三种浓度。然后将测试品以三种浓度添加到共9个样品的微粒体中。强化基质样品三次转移到HTD供体室，抗磷酸盐透析5小时。
• 微粒体中的稳定性：将来自上述的强化基质样品在37℃下在5％CO中孵育₂为0和5小时。